Come utilizzare Sanger Reagenti

reagente di Sanger è utilizzato per determinare la sequenza di amminoacidi che compongono un peptide . Il reagente si aggancerà - o tag - l'amminoacido alla fine di una catena peptidica , noto anche come la N -terminale . Il peptide può essere suddiviso in pezzi ( idrolizzato ) e singoli aminoacidi esaminato utilizzando vari metodi di cromatografia . Qualunque amminoacido porta il tag è quella alla fine . Reagente di Sanger è anche conosciuto come dinitrofluorobenzene ( DNFB ) . Una volta che ha afferrato un aminoacido , viene indicato come un DNP - compound.Things che vi serve
scala di laboratorio
Guanti
Occhiali di sicurezza
centrifuga
tubi centrifuga
Pasteur pipette
acqua distillata
soluzione 4,2 % di bicarbonato di sodio
reagente di Sanger ( FDNB )
pH carta
etere etilico
soluzione 6M di acido cloridrico
Acetone
test tubo

Mostra Altre istruzioni
1

pesare 3 milligrammi di peptide su una scala . Mettere in una provetta da centrifuga . Aggiungere circa 0,3 ml di acqua , 0,3 ml di reagente di Sanger e 0,075 ml di bicarbonato di sodio .
2

Lasciare la provetta da centrifuga a incubare a temperatura ambiente per un'ora . Durante l'incubazione , agitare delicatamente il tubo per impedire la miscela da separare . Controllare il pH della soluzione ogni 15 minuti con carta pH . Il pH dovrebbe essere mantenuto al di sopra 9 . Se si inizia a scendere , aggiungere una piccola quantità di bicarbonato di sodio (circa una goccia con la pipetta Pasteur ) .
3

Dopo l'incubazione , aggiungere 1.5 ml di acqua e una pari quantità di etere . Lasciare che la soluzione di separare in strati. Potrebbe essere necessario centrifugare la miscela per separarlo . Rimuovere lo strato di etere (la parte superiore , strato giallo) con una pipetta e scartarla .
4

Regolare il pH fino a 1,0 aggiungendo lentamente l'acido cloridrico . Aggiungere un po 'di acido alla volta , mescolate delicatamente , quindi controllare il pH con la carta pH . Complessivamente , dovrebbe richiedere circa 0,15 ml di acido . Se il pH scende sotto 1,0 , aggiungere una piccola quantità ( non più di una goccia ) di bicarbonato di sodio .
5

Aggiungere 3 ml di etere . Lasciare il composto per separare . Ora lo strato superiore ( lo strato di etere giallo) contiene la DNP - composto. Usando una pipetta , estrarre con attenzione questo livello e trasferirlo in una provetta pulita. Collocare la provetta da parte e lasciare evaporare , lasciando dietro di sé un luogo asciutto, solido giallo .
6

Lavare il solido con acetone . Aggiungere 0.3 mililiters di acetone , agitare delicatamente ed estrarre il liquido con una pipetta . Aggiungere 0,75 mililiters di acido nella provetta . Il tuo peptide è ora etichettato e pronto per essere idrolizzato e analizzati con il metodo di cromatografia di vostra scelta .