Come calibrare colonne Gel filtrazione

colonne di filtrazione gel sono usati per separare le proteine ​​da miscele complesse . Poiché ogni proteina ha un peso molecolare unica , possono essere indotti a separarsi in strati distinti da loro migrazione attraverso una colonna di filtrazione contenente una matrice gel uniformemente distribuita . Per identificare correttamente ogni proteina che è separata fuori , è necessario calibrare le colonne utilizzando diverse proteine ​​di weight.Things molecolari noti che ti serviranno
anidrasi carbonica
citocromo C
Aprotinin
sale basale
tubi per centrifuga
ferritina
Centrifuga
Dispensare Pompa
250 ml cilindro graduato
tampone liquido
pulizia scientifico salviette
siringa
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Rimuovere le fiale di carbonica , citocromo C e aprotinin dal frigorifero o freezer e permettere loro di raggiungere la temperatura ambiente . Aggiungere 4 mg di ogni proteina in una provetta da centrifuga per millilitro di gel sulla colonna di filtrazione . Aggiungere 961 mcl di sale basale per milligrammo di proteina per ogni provetta da centrifuga per sciogliere le proteine ​​. Aggiungere 39,2 mcl di ferritina per millilitro di gel in ogni provetta e poi mescolare in una centrifuga .
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Spegnere la pompa colonna di filtrazione e chiudere il rubinetto all'ingresso della colonna . Allentare , ma non rimuovere , la parte superiore della colonna di filtrazione . Impostare la pompa alla portata massima della colonna e riavviare la pompa fino a che il materiale paracolpi è stata prelevata . Fermare la pompa .
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Aggiungere 1 ml di ogni proteina alla colonna di filtraggio utilizzando una pompa pipetta . Gocciolare le proteine ​​lungo l'interno della colonna da un'altezza di 1 cm a 2 cm , lavorando intorno al bordo interno della colonna . Lasciare che la miscela proteica a stabilirsi sulla parte superiore della matrice gel .
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Posizionare il tubo all'uscita della pompa in un ambiente pulito e asciutto da 250 ml cilindro graduato . Riavviare la pompa ad una velocità di 0.30 ml al minuto ed eseguire le proteine ​​nella matrice gel . Mentre la pompa è in funzione , risciacquare le pareti del tubo utilizzando la pompa pipetta e una piccola quantità di liquido tampone . Una volta che le proteine ​​sono completamente entrato nella matrice gel , ridurre la velocità della pompa a 0,02 ml per minuto e pompa in 5 cm a 7 cm di liquido tampone sulla parte superiore della matrice .
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staccare l' cap colonna dal rubinetto . Pulire il tappo colonna e l'interno della colonna utilizzando salviettine detergenti scientifici . Reinstallare il tappo della colonna . Riempire il serbatoio tampone con liquido tampone . Collegare una siringa al rubinetto e aprirlo . Usare la siringa per disegnare una piccola quantità di tampone attraverso il tubo e nella siringa . Chiudere il rubinetto e ricollegare alla parte superiore della colonna . Aprire il rubinetto e controllare eventuali perdite .
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Eseguire la colonna a 0.02 ml per minuto per diversi giorni , fino a quando la band ferritina si avvicina alla fine della colonna . Raccogliere tutto il gel filtrazione che viene pompata nel cilindro graduato .