Asciugatura Metodi Protocollo per PVDF

Quando vincolante acidi nucleici o le proteine ​​, un materiale forte legame chiamato PVDF ( polivinile difluoride ) membrana fornisce il supporto per gli anticorpi . Attraverso Western blotting , le membrane sono accatastati insieme , preparati per l'anticorpo e poi asciugati . Protocollo per asciugare la membrana richiede la conoscenza di come funzionano membrane , piastre catodiche , piastre anodiche e applicazione di soluzioni metanolo . Con il protocollo corretto , la membrana si lega in modo sicuro con l'anticorpo specifico ed è pronto per l'uso o stoccaggio immediato . Preparazione della membrana

Preparare la membrana PVDF pulisce e stabilizza la membrana prima del trasferimento . Prima di essiccazione , la membrana viene " bloccato " per impedire vincolante da qualcosa di diverso da acidi nucleici specifici , quali anticorpi aspecifici . Durante questa procedura , bagnare la membrana ponendo su una superficie piana ricoperta in metanolo . La membrana cambia colore durante questa frase , da opaca a semitrasparente . Una volta terminata la vasca metanolo , la membrana viene posta in acqua deionizzata a bagno per circa due minuti . La membrana deve poi immergersi di nuovo in una soluzione di metanolo che è molto acido .
Assemblea delle membrane prima del trasferimento

Due delle carte di membrana sono imbevuto nella prima soluzione di metanolo e posto su una piastra anodica . Durante questo processo , è necessario controllare attentamente bolle d'aria intrappolate , che potrebbe compromettere il trasferimento . Un altro pezzo di carta da filtro è impregnato nella seconda soluzione di metanolo e posto in cima alla pila . Un gel va poi sopra della membrana , con attenzione a non intrappolare bolle d'aria tra l'applicazione del gel e la membrana . Tre nuovi pezzi di carta vengono quindi immersi in un buffer catodo e posizionati sopra il gel . Se si verifica un gorgoglio d'aria , una provetta lavora per appianare le membrane .
Transfer

In questa parte del processo , si connette ad alta tensione cavi di alimentazione e applicare una corrente costante alla zona gel sulla membrana per 30 minuti . I tempi di trasferimento variano a seconda del tipo di anticorpo . Dopo 30 minuti , si rimuove l'alimentazione e la membrana di trasferimento. L'angolo in basso a destra della membrana viene poi tagliata a controllare l'orientamento . I primi due strati di carta filtro vengono scartati , compreso il gel . Le bande di peso molecolare sono contrassegnati con una penna a sfera .
Asciugatura

Una volta completato il trasferimento , asciugare la membrana in uno dei due modi . Per un'asciugatura più rapida , la membrana viene immerso in 100 per cento metanolo per 10 secondi per rimuovere l'acqua . La membrana poggia quindi su un pezzo di carta assorbente per 15 minuti . Per un metodo di essiccamento lento , la membrana viene posta sul tovagliolo di carta senza aggiungere metanolo . Una volta essiccato , la membrana può essere utilizzato o conservato in un contenitore asciutto a 4 gradi centigradi per un uso futuro .