Come estrarre il DNA da foglie di piante

Impianto materia organica è costituito da molte cellule , ognuna delle quali contiene il DNA che contiene le istruzioni per la crescita e la funzione . Gli scienziati potrebbero voler studiare una parte o tutto il materiale genetico presente nelle cellule , e quindi necessario estrarre in modo sicuro il DNA dal materiale strutturale e macchinario cellulare che circonda it.Things Hai bisogno
2 grammi di foglie
pestello e mortaio
Centrifuga
Bagnomaria
Balance
Garza
provette per centrifuga Six 15ml
One 1,5 ml Eppendorf tubo
100ml CTAB Extraction Buffer
2ml Beta - mercaptoethanol
7ml 24 : 1 Cloroformio : Isoamylalcohol miscela
50 microlitri di RNase A in una concentrazione di 10 mg /ml
Pipettes
6ml isopropanolo
2ml 70% etanolo
1 ml di acqua sterile deionizzata

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Riempire il bagnomaria al livello raccomandato con l'acqua , che varia con le specifiche di ogni costruttore , e accenderlo . Impostare il bagnomaria a 65 gradi Celsius e farlo venire in temperatura. Posizionare il contenitore isopropanolo sul ghiaccio . Impostare la centrifuga a 3000 giri al minuto ad una temperatura di 20 gradi Celsius .
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Pesare 2 g di foglie su un equilibrio e metterli in un mortaio . Aggiungere abbastanza beta - mercaptoetanolo tramite pipetta ad un contenitore di tampone di estrazione in modo che il prodotto finale è costituito da uno a due per cento di beta - mercaptoetanolo . Ad esempio , se si dispone di un volume di buffer che misura circa 100 ml , aggiungere 2 ml di beta - mercaptoetanolo al contenitore e mescolare accuratamente .
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Pipetta tampone di estrazione 7 ml nel mortaio . Schiacciare il composto in un liquido omogeneo con il pestello .
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Piegare un pezzo di garza sopra per formare quattro strati . Filtrare e spremere il liquido attraverso gli strati in una provetta da centrifuga da 15 ml .
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Mettere la provetta a bagnomaria per 30to 60 min uti . Agitare la provetta per mescolare il contenuto di ogni quarto d'ora . Lasciare il tubo raffreddare a temperatura ambiente dopo il periodo di tempo è scaduto.
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Rabboccare il tubo con il cloroformio e la miscela isoamylalcohol ( questo contiene 24 parti di cloroformio per una isoamylalcohol parte ) , in modo che il tubo contiene circa la metà del campione e mezzo la nuova aggiunta liquido . Tappare la provetta e capovolgerla un paio di volte lentamente in modo che il mix fluido .
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Mettere la provetta in centrifuga e farlo girare per 10 minuti .
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Inserire 50 ml RNAse a in una nuova provetta da centrifuga . Pipettare il supernatante ( lo strato trasparente nella parte superiore del tubo sopra uno strato bianco di detriti ) nel primo tubo e spostare al secondo tubo . Tappare la provetta e invertire un paio di volte per mescolare il contenuto insieme . Mantenere il tubo a temperatura ambiente per un'ora .
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Eseguire i punti 6 e 7, di nuovo due volte in modo da avere una provetta chiara . Pipettare quindi fino a 9 ml di liquido chiaro dal tubo finale in un nuovo tubo . Aggiungere 6 ml di isopropanolo e invertire i tubi 10 volte in un modo delicato così il DNA cade dalla soluzione e in una forma solida . Poi centrifugare la provetta per 10 minuti, che dovrebbero creare un pellet di DNA nel fondo della provetta .
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Versare il liquido nel tubo in modo che il pellet rimane. Pipettare in 2 ml di etanolo al 70% e posto indietro nella centrifuga per cinque minuti . Versare la porzione liquida di nuovo . Utilizzare una pipetta sterile per prendere il pellet e spostarlo in una sterile provetta Eppendorf da 1,5 ml . Pipettare in 200 microlitri di acqua deionizzata sterile e lasciare che il DNA sciogliere completamente nel liquido , che può assumere durante la notte . Il campione è quindi pronto per l'analisi .