Come preparare una goccia

Per determinare la struttura 3D di una proteina , è necessario prima un cristallo puro di esso . Il metodo impiccagione -drop utilizza una goccia di soluzione contenente proteine ​​appeso da un coprioggetto . Sotto questa goccia appeso si trova un serbatoio con una concentrazione di sale superiore a quella della goccia . Nel tempo , il vapore acqueo lascia la goccia e finisce nel serbatoio , provocando la proteina di cristallizzare . Ogni proteina richiede condizioni diverse ( quali la concentrazione di sale e pH ) , e spesso tentativi ed errori offre l'unico modo per trovare le giuste conditions.Things Hai bisogno
laboratorio cappotto , guanti e occhiali di protezione
Micropipetta con pipetta suggerimenti
1 soluzione molare di cloruro di sodio in tampone acetato 0,05 molare , pH 4,7
2 tubi mL Eppendorf ( o simile )
Centrifuga
piastra
24 - ben grasso per vuoto in siringa
siliconati coprioggetto
compressa Pinzette
aria
clay ( ad esempio argilla modellazione o simili )
50 mg /ml di lisozima in 0,05 soluzione tampone di acetato molare , pH 4,7
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1

Indossare attrezzatura da laboratorio ( camice , guanti e occhiali di protezione ) .
2

Utilizzare una micropipetta per aggiungere 1,1 ml di cloruro di sodio ( sale) e la soluzione tampone acetato in una provetta Eppendorf .
3

Centrifugare la provetta Eppendorf chiusa con soluzione di sale interno per circa cinque minuti a 13.000 rpm . Ricordate di bilanciare la centrifuga ponendo un altro tubo Eppendorf contenente 1,1 ml di acqua di fronte e di fronte al tubo di soluzione salina .
4

Aggiungere 1 ml della soluzione di sale di un pozzo in un ben 24 piastra .
5

Utilizzare una siringa riempita di grasso per posizionare un sottile strato di grasso intorno al bordo di questo bene . Fare attenzione a non aggiungere troppo o troppo poco . Se si aggiunge troppo grasso, il grasso verrà eseguito giù nel pozzo e forse rovinare il vostro esperimento . Se si usa troppo poco , il bene non sarà tenuta d'aria e l'esperimento non funziona . Obiettivo per quel tanto che basta il grasso che il coprioggetto e grasso formano una chiusura ermetica in seguito .
6

Stendete l'argilla con le mani per fare quattro palline , e spingerli sui quattro angoli della 24- pozzetti . Essi agiscono come supporti per garantire la copertura della piastra non entrare in contatto con il coprioggetto .
7

Utilizzare aria compressa per soffiare la polvere fuori del coprioggetto . Tenere il vetrino con un paio di pinzette pulite .
8

Aspirare 4 microlitri di soluzione di lisozima con la micropipetta , ed aggiungere questa soluzione al centro del vetrino . Cambiare i puntali delle pipette , e aggiungere 4 microlitri della soluzione di sale . Pipettare delicatamente su e giù , succhiare nel liquido poi espellerla , per mescolare la soluzione salina con la soluzione di lisozima . Fare attenzione a mescolare il due senza disperdere il liquido in tutto il coprioggetto .
9

Girare il coprioggetto sopra rapidamente in modo che il liquido non scivolare , e la pianta è esattamente in cima al pozzo . Fare attenzione a premere delicatamente su di esso in modo che forma una chiusura ermetica con il grasso tutto intorno ai bordi del pozzo .
10

Spingere il coperchio della piastra a 24 pozzetti sulle palle di argilla , e lasciare il piatto in un luogo fresco .